Nuôi cấy mô là cách tạo ra nhiều cây cần sa giống hệt nhau từ một mẩu rất nhỏ lấy từ cây mẹ. Mẩu này được nuôi trong hộp vô trùng, trên một lớp thạch có chất dinh dưỡng. Người trồng dùng phương pháp này cho ba việc: loại bỏ viroid và virus, nhân một giống thành hàng nghìn cây đồng đều, và lưu giữ giống mà không cần nuôi cây mẹ.
Phần 1 giải thích nuôi cấy mô khác giâm cành ở điểm nào và những hormone nào điều khiển quá trình này. Sau đó, bài đi lần lượt qua bốn giai đoạn thực hành, kèm công thức và kết quả đã được công bố. Phần 2 nói về cách làm sạch cây nhiễm viroid, dựng một phòng lab nhỏ, các vấn đề riêng của cần sa, cách lưu giữ giống và vận hành phòng nuôi cấy trong cái nóng ở Thái Lan.
Bài này tổng hợp từ tám nghiên cứu đã công bố, không dựa trên một bài gốc duy nhất. Danh sách nằm ở mục Tài liệu tham khảo cuối bài. Các số trong ngoặc vuông là số thứ tự của tài liệu tương ứng.
1. Nuôi cấy mô là gì và vì sao người trồng cần sa dùng phương pháp này
Phần lớn người trồng nhân giống bằng giâm cành truyền thống. Bạn cắt một cành, nhúng thuốc kích rễ rồi chờ cành ra rễ. Cách này đã cho kết quả tốt suốt nhiều chục năm. Điểm yếu của nó là mỗi cành giâm mang theo mọi vấn đề của cây mẹ.
Trong số đó có virus và viroid. Viroid là những sợi RNA rất nhỏ có khả năng gây bệnh, còn nhỏ hơn cả virus. Loại gây hại nặng nhất cho cần sa là Hop Latent Viroid (HLVd). Cành giâm cũng mang theo vi khuẩn sống bên trong mô cây.
Sau nhiều năm giâm cành nối tiếp từ cành giâm, các thay đổi di truyền nhỏ cũng tích tụ dần. Hiện tượng này gọi là trôi dạt di truyền (genetic drift), một trong những nguyên nhân gây thoái hoá giống. Cành giâm cũng truyền các thay đổi này sang cây mới.
Nuôi cấy mô, còn gọi là vi nhân giống (micropropagation), bắt đầu từ một mẩu nhỏ hơn nhiều. Thường đó là đỉnh sinh trưởng (meristem), tức điểm đang phát triển ở tận đầu ngọn. Mẩu này có thể chỉ nhỏ 0,4–0,5 mm. Mẩu mô bạn đặt vào môi trường nuôi cấy được gọi là mẫu cấy (explant).
Mẫu cấy lớn lên trong hộp vô trùng, trên thạch dinh dưỡng, dưới ánh sáng và nhiệt độ được kiểm soát. Từ một mẫu cấy, bạn có thể tạo ra rất nhiều cây con (plantlet) giống hệt nhau về di truyền. Cây con là những cây nhỏ hình thành ngay trong hộp. Nếu mẫu cấy đủ nhỏ, cây con sẽ sạch các mầm bệnh mà cành giâm thường truyền sang.
Phương pháp này không mới. Năm 1962, Murashige và Skoog công bố môi trường dinh dưỡng của họ, ban đầu dùng cho mô cây thuốc lá. Đến nay, đây vẫn là công thức nền [5]. Chuối, lan, khoai tây và dâu tây đã được nhân giống thương mại theo cách này từ nhiều chục năm. Người trồng cần sa áp dụng muộn hơn, vì ba lý do:
- HLVd lây lan âm thầm qua các farm thương mại. Bệnh được ghi nhận lần đầu trên cần sa ở bang California (Mỹ) năm 2019 [3]. Một bài tổng quan năm 2023 cho biết khoảng 90% cơ sở trồng cần sa ở California có kết quả xét nghiệm dương tính. Ở mỗi cơ sở, khoảng 30% số cây có triệu chứng. Bài tổng quan ước tính ngành chịu thiệt hại tới 4 tỷ USD mỗi năm [1].
- Chuỗi cung ứng dược liệu đòi hỏi chứng minh nguồn gốc. Farm làm theo GACP hoặc GMP phải truy được từng sản phẩm về tận cây mẹ. GACP (Thực hành tốt trồng trọt và thu hái) là tiêu chuẩn cho farm trồng cây dược liệu. GMP (Thực hành tốt sản xuất) là tiêu chuẩn cho khâu sản xuất thuốc.
- Farm lớn có giấy phép cần số lượng. Một cơ sở có thể cần hàng chục nghìn cây đồng đều cho mỗi vụ.
Ghi chú của người dịch: Thái Lan đã có ngành nuôi cấy mô thương mại cho lan và các loại cây cảnh khác. Nhưng có phòng lab nào bán cây con cần sa sạch bệnh hay nhận xét nghiệm HLVd cho cần sa hay không lại là chuyện khác. Người dịch chưa tìm thấy phòng lab nào ở Thái công khai nhận một trong hai dịch vụ này. Khi chưa tìm được dịch vụ như vậy, bạn nên tính tới việc tự làm ở quy mô nhỏ, hoặc quản lý cây mẹ thật cẩn thận.
Việc cần làm: Trước khi mua bất kỳ thiết bị nào, hãy đặt câu hỏi trong mục Nuôi cấy mô của diễn đàn. Hỏi xem đã có thành viên nào dùng phòng lab ở Thái để làm cây con cần sa hoặc xét nghiệm HLVd chưa. Hỏi thêm chi phí và thời gian mất bao lâu.
2. So sánh giâm cành và nuôi cấy mô
| Giâm cành truyền thống | Nuôi cấy mô | |
|---|---|---|
| Vật liệu ban đầu | Cành giâm dài 10–15 cm | Đỉnh sinh trưởng 0,4–5 mm, hoặc đoạn thân có mầm |
| Bệnh | Mang theo mọi bệnh của cây mẹ | Có thể loại bỏ viroid, virus và vi khuẩn |
| Sản lượng từ một cây mẹ | 10–30 cành mỗi lần cắt | Hàng trăm đến hàng nghìn cây con từ một mẫu cấy |
| Thời gian ra cây có rễ | 10–14 ngày | 6–12 tuần, nhưng được nhiều cây cùng lúc |
| Ổn định di truyền | Trôi dạt dần qua nhiều năm | Ổn định khi chồi mới mọc ra từ chồi có sẵn |
| Không gian | Phòng cây mẹ | Phòng lab nhỏ |
| Tay nghề | Người mới làm được | Trung bình đến nâng cao |
| Chi phí | Rất thấp | Trung bình đến cao |
| Lưu giữ lâu dài | Phải giữ cây mẹ sống | Có thể giữ mẫu cấy trong nhiều tháng |
Hãy xem bảng này như lựa chọn giữa hai công cụ. Nuôi cấy mô không thay thế giâm cành trong mọi trường hợp. Nó giải quyết những việc cụ thể mà giâm cành không làm được: loại bỏ viroid và virus, tạo lô cây rất lớn và đồng đều, lưu giữ giống mà không cần cây mẹ còn sống.
Ghi chú của người dịch: Ở Thái Lan và Đông Nam Á, nhiều người bắt đầu trồng giống mới bằng cách mua cành giâm từ farm khác. Đây là con đường nhanh nhất để mang nhện đỏ và bọ trĩ, nấm phấn trắng hoặc HLVd về farm. Bạn cũng có thể mua phải cây bị bán sai tên giống. Hãy để cành mua về ở khu riêng, cách xa cây mẹ. Soi kỹ bằng kính lúp trước khi đưa vào phòng trồng chính. Hỏi người bán xem cây mẹ đã xét nghiệm HLVd chưa, ở phòng lab nào và vào lúc nào.
Việc cần làm: Ghi ra những vấn đề bạn đang thực sự gặp, như cây có triệu chứng nhiễm viroid, lô cây không đều, hay không đủ tiền duy trì phòng cây mẹ. Nếu không gặp vấn đề nào trong số đó, giâm cành có lẽ vẫn là cách phù hợp với bạn.
3. Cơ sở sinh học của vi nhân giống
Mỗi tế bào thực vật còn sống đều có thể tái tạo cả một cây
Tế bào thực vật có tính toàn năng (totipotency). Nghĩa là bất kỳ tế bào thực vật nào còn sống cũng mang đủ thông tin di truyền để mọc lại thành một cây hoàn chỉnh. Tế bào động vật mất khả năng này từ rất sớm trong quá trình phát triển. Nhờ tính toàn năng mà nuôi cấy mô mới thực hiện được.
Trên môi trường thạch có tỷ lệ hormone phù hợp, mô cây có thể được đẩy theo bốn hướng. Mô có thể tăng sinh thành mô sẹo (callus), tức một khối tế bào chưa phân hoá. Mô cũng có thể tạo chồi, hoặc tạo rễ. Ở mức nâng cao, mô có thể tạo phôi hoàn chỉnh từ tế bào thân bình thường thay vì từ hạt (phôi soma).
Hai nhóm hormone điều khiển mẫu cấy
Mẫu cấy phát triển theo hướng nào chủ yếu phụ thuộc vào tỷ lệ giữa hai nhóm hormone thực vật.
| Nhóm hormone | Ví dụ | Tác dụng khi nồng độ cao |
|---|---|---|
| Cytokinin (hormone thúc tạo chồi và mầm) | BAP (6-benzylaminopurine), kinetin, TDZ (thidiazuron) | Ra nhiều chồi mới hơn |
| Auxin (hormone thúc ra rễ; IBA cũng được bán dưới dạng bột kích rễ cho cành giâm) | IBA (indole-3-butyric acid), NAA (naphthaleneacetic acid), 2,4-D | Ra nhiều rễ hơn |
- Cytokinin cao, auxin thấp: một mẫu cấy ra nhiều chồi mới (giai đoạn nhân chồi).
- Cytokinin thấp, auxin cao: chồi ra rễ (giai đoạn ra rễ).
- Cân bằng, hoặc auxin cao: hình thành mô sẹo.
Tỷ lệ này là thông số quan trọng nhất mà bạn điều chỉnh được. Đúng tỷ lệ thì chồi nhân lên hiệu quả. Sai tỷ lệ thì bạn chỉ thu được mô sẹo, hoặc mẫu không phát triển gì. Ở cần sa, mô sẹo hiếm khi tạo lại chồi, lại còn kèm rủi ro về di truyền (mục 7, Phần 2).
Các công thức ở mục 4 đi theo đúng logic này qua từng giai đoạn:
| Giai đoạn | Cytokinin | Auxin | Tỷ lệ |
|---|---|---|---|
| Khởi tạo | 0,5 mg/L BAP | 0,1 mg/L NAA | 5 : 1, đẩy nhẹ về phía tạo chồi |
| Nhân chồi (công thức BAP) | 1,0–2,0 mg/L BAP | 0,1 mg/L NAA | 10–20 : 1, đẩy mạnh về phía tạo chồi |
| Nhân chồi (công thức TDZ) | 0,5 µM TDZ | Không có | Chỉ có cytokinin |
| Ra rễ | Không có | 2,5 µM IBA | Chỉ có auxin |
Kiểu gen quyết định rất nhiều
Kiểu gen (genotype) là bộ gen của một giống hoặc một cây cụ thể. Phần lớn công thức nuôi cấy cần sa đã công bố được tinh chỉnh trên một giống duy nhất. Các kiểu gen khác có thể phản ứng rất khác.
Năm 2021, nhóm nghiên cứu của Monthony tại Đại học Guelph (Canada) công bố một bài tổng quan về nuôi cấy mô cần sa [4]. Trong các nghiên cứu trên cây gai dầu (hemp) mà nhóm tổng hợp, tỷ lệ tạo mô sẹo trên cuống lá dao động từ 27% đến 83%, tuỳ giống. Tỷ lệ tái sinh từ trụ dưới lá mầm (hypocotyl) dao động từ 2% đến 71%, tuỳ loại mô nguồn và giống. Trụ dưới lá mầm là đoạn thân cây con nằm bên dưới những lá đầu tiên.
Vì vậy, một công thức rất hiệu quả trên giống này có thể thất bại hoàn toàn trên giống khác. Hãy coi mọi công thức trong bài là điểm xuất phát. Sau đó, điều chỉnh dần trên chính giống của bạn.
Việc cần làm: Với mỗi giống mới, chạy thử công thức trên một lô nhỏ trước. Đếm xem bao nhiêu mẫu cấy có phản ứng rồi mới mở rộng quy mô.
4. Bốn giai đoạn vi nhân giống cần sa
Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
Nuôi cây mẹ trong điều kiện sạch ít nhất 2 tuần trước khi lấy mô. Trong thời gian này, không phun qua lá và không dùng thuốc bảo vệ thực vật. Bón dung dịch cân đối, nồng độ vừa phải. Giữ cây ở trạng thái sinh trưởng thân lá mạnh với chu kỳ đèn 18/6 (bật 18 giờ, tắt 6 giờ). Mục tiêu là có chồi non mọc nhanh, không dính dư lượng thuốc phun.
Nếu có thể, hãy xét nghiệm HLVd cho cây mẹ bằng RT-qPCR trước khi bắt đầu. RT-qPCR là xét nghiệm trong phòng lab để phát hiện và đo lượng vật liệu di truyền của viroid. Kết quả cho bạn biết nên dùng loại mẫu cấy nào. Cây mẹ đã xét nghiệm sạch thì bạn dùng được đoạn thân, loại dễ làm hơn. Cây mẹ bị nhiễm hoặc chưa xét nghiệm thì phải dùng đỉnh sinh trưởng (Giai đoạn 1).
Ghi chú của người dịch: Khi xử lý cây mẹ ngoài khoảng 2 tuần này, chỉ dùng thuốc bảo vệ thực vật đã đăng ký với Cục Nông nghiệp Thái Lan (กรมวิชาการเกษตร). Dùng đúng theo hướng dẫn trên nhãn. Xem thêm những gì được phép phun theo GACP Thái. Nếu không tìm được nơi xét nghiệm HLVd ở Thái, hãy coi như cây mẹ có thể đã nhiễm và làm từ đỉnh sinh trưởng.
Việc cần làm: Đánh dấu cây mẹ sẽ dùng, ngưng mọi lần phun trên cây đó và ghi lại ngày ngưng. Chỉ bắt đầu Giai đoạn 1 sau ít nhất 14 ngày.
Giai đoạn 1: Khởi tạo — tạo mẫu cấy sạch ban đầu
Đây là giai đoạn quan trọng nhất, và cũng hay thất bại nhất. Mục tiêu là đưa một mẩu mô cây vào hộp vô trùng mà không mang theo bất kỳ vi sinh vật nào.
Chọn mẫu cấy
- Đỉnh sinh trưởng (meristem) là lựa chọn khi cần loại bỏ viroid. Phần vòm ở tận đầu chồi đang mọc thường sạch mầm bệnh, kể cả khi phần còn lại của cây đã nhiễm. Lý do là hệ mạch dẫn (các kênh vận chuyển bên trong cây) chưa mọc tới phần này.
- Nhóm của Punja (Đại học Simon Fraser, Canada) dùng đỉnh dài 0,4 mm, có tối đa hai mầm lá [2]. Mầm lá (leaf primordia) là những nốt nhỏ sau này sẽ thành lá.
- Năm 2023, nhóm của Adkar-Purushothama đăng một bài tổng quan trên tạp chí Viruses, so sánh các cách loại bỏ HLVd [1]. Kết quả cho thấy nuôi cấy đỉnh dưới 0,5 mm kết hợp xử lý lạnh hiệu quả hơn dùng riêng từng cách.
- Bạn cần kính lúp hoặc kính hiển vi để cắt mô nhỏ cỡ này.
- Đoạn thân có mắt (nodal segment) là đoạn thân dài 5–10 mm, có một mắt lá kèm mầm. Loại này dễ thao tác hơn, người mới làm cũng thành công nhiều hơn. Đoạn thân không loại bỏ được viroid. Chỉ dùng loại này để nhân giống khi cây mẹ đã xét nghiệm sạch.
Khử trùng bề mặt mẫu cấy (cách làm tiêu chuẩn)
- Rửa dưới vòi nước chảy trong 5 phút.
- Nhúng vào cồn 70% trong 30 giây.
- Ngâm 10–15 phút trong sodium hypochlorite 1–2% (nước tẩy gia dụng pha loãng khoảng 1:5), thêm 1–2 giọt Tween-20. Tween-20 là chất tẩy rửa nhẹ, giúp nước tẩy thấm đều toàn bộ bề mặt.
- Tráng 3 lần bằng nước cất vô trùng bên trong tủ cấy hoặc hộp thao tác, để rửa sạch nước tẩy.
- Cắt tỉa về kích thước cuối cùng bằng dao mổ vô trùng.
- Đặt lên môi trường khởi tạo.
Ghi chú của người dịch: Nước tẩy gia dụng bán ở Thái có nồng độ khác nhau. Hãy đọc tỷ lệ sodium hypochlorite trên nhãn rồi pha loãng về 1–2%. Ví dụ, sản phẩm 6% pha 1 phần nước tẩy với 4 phần nước sẽ được dung dịch 1,2%. Dùng loại nước tẩy thường, không thêm hương liệu hay chất làm đặc.
Một môi trường khởi tạo phổ biến (nền MS)
- Muối khoáng nền và vitamin Murashige & Skoog (MS), hỗn hợp khoáng và vitamin tiêu chuẩn cho mô thực vật [5]
- 30 g/L sucrose (đường thường, nguồn năng lượng cho mô trong hộp)
- 0,5 mg/L BAP (cytokinin)
- 0,1 mg/L NAA (auxin)
- 7 g/L agar (chất tạo gel từ rong biển, giúp môi trường đông lại)
- Chỉnh pH về 5,7–5,8 trước khi tiệt trùng môi trường bằng nồi hấp tiệt trùng (autoclave, thiết bị tiệt trùng bằng hơi nước áp suất cao) hoặc nồi áp suất
Hormone được đong từ dung dịch gốc (stock) nồng độ 1 mg/mL, bảo quản đông lạnh (cách pha ở mục 6, Phần 2). Ở nồng độ này, cho 1 mL dung dịch gốc vào 1 lít môi trường sẽ được 1 mg/L. Vậy công thức trên cần 0,5 mL dung dịch gốc BAP và 0,1 mL dung dịch gốc NAA cho mỗi lít.
Kết quả cần thấy. Trong 2–4 tuần, mẫu cấy phải xanh lên và lớn dần, có lá mới mọc ra từ đỉnh sinh trưởng hoặc từ mắt. Môi trường bị đục hoặc ngả vàng nghĩa là mẫu đã nhiễm. Có lớp mốc xốp như bông cũng vậy. Bỏ các hộp nhiễm mà không mở nắp trong khu làm việc, để bào tử không phát tán.
Hao hụt ở giai đoạn này là bình thường và có thể rất nhiều. Làm trong hộp thao tác kín thường hao hụt nhiều hơn làm trong tủ cấy dòng khí. Hộp thao tác kín (still air box) là hộp nhựa trong, đậy kín, có lỗ để luồn tay vào. Tủ cấy dòng khí (laminar flow hood) là tủ thổi luồng khí đã lọc ngang qua mặt bàn làm việc.
Hãy tính trước phần hao hụt: khởi tạo 10–20 mẫu cấy cho mỗi mẫu bạn cần giữ lại. Thất bại lúc đầu không có nghĩa là phương pháp này không hiệu quả.
Việc cần làm: Dán nhãn từng hộp với ngày cấy, cây mẹ và loại mẫu cấy. Đến tuần thứ 4, đếm số hộp sạch và số hộp nhiễm. Con số này cho bạn tỷ lệ hao hụt của riêng mình để lập kế hoạch.
Giai đoạn 2: Nhân chồi
Giai đoạn nhân chồi bắt đầu khi Giai đoạn 1 đã cho bạn các mẫu cấy sạch, đang phát triển. Cứ 3–4 tuần, mở từng hộp trong tủ cấy hoặc hộp thao tác. Tách mỗi cụm thành từng chồi đơn hoặc cụm nhỏ, rồi chuyển từng phần sang môi trường mới. Mỗi lần chuyển như vậy gọi là một lần cấy chuyền (subculture).
Môi trường nhân chồi (nền BAP, dùng chung)
- Muối khoáng nền MS
- 30 g/L sucrose
- 1,0–2,0 mg/L BAP (1–2 mL dung dịch gốc 1 mg/mL cho mỗi lít)
- 0,1 mg/L NAA (0,1 mL dung dịch gốc cho mỗi lít)
- 7 g/L agar
- pH 5,7–5,8
Công thức cần sa đã công bố, dùng TDZ. Công thức nuôi cấy cần sa được trích dẫn nhiều nhất là của nhóm Lata (2009) [6], một nhóm nghiên cứu tại Đại học Mississippi (Mỹ). Họ dùng môi trường MS với 0,5 µM thidiazuron (TDZ), tức khoảng 0,11 mg/L. µM (micromol/lít) là đơn vị đo nồng độ theo số phân tử, không theo khối lượng.
Ở liều này, 100% mẫu cấy có phản ứng, cho trung bình 12,6 chồi trên mỗi mẫu cấy.
Hãy để ý liều này thấp đến mức nào. TDZ rất mạnh, và dùng nhiều hơn không cho kết quả tốt hơn. Dư TDZ trực tiếp làm chồi bị trong, mọng nước (hiện tượng thuỷ tinh hoá – hyperhydricity, mục 7, Phần 2). Đong 0,11 mL rất khó, nên hãy pha dung dịch gốc TDZ loãng hơn: ở nồng độ 0,1 mg/mL, bạn cho 1,1 mL vào mỗi lít.
Nhiều mẫu cấy suy yếu ở giai đoạn này. Phần lớn bài giới thiệu bỏ qua điểm này. Nhóm của Monthony ghi nhận số mẫu tái sinh lấy từ cây ở Giai đoạn 1 giảm 74–82% [4]. Sự suy giảm thể hiện qua chồi bị thuỷ tinh hoá, mô sẹo mọc ngoài ý muốn, và mẫu cấy chết dần.
Nhân chồi ở cần sa là có thật, nhưng không tăng gấp đôi đều đặn mỗi chu kỳ như khi tính trên giấy. Hãy lập kế hoạch dựa trên kết quả thực tế của giống bạn qua nhiều chu kỳ, không dựa trên tốc độ lý thuyết.
Việc cần làm: Mỗi giống dùng một bảng ghi chép riêng. Ở mỗi lần cấy chuyền, ghi số chồi đưa vào và số chồi thu được. Ghi cả số chồi bị thuỷ tinh hoá, tạo mô sẹo hoặc chết.
Giai đoạn 3: Ra rễ
Khi đã đủ chồi, chuyển từng chồi đơn sang môi trường ra rễ. Lúc này, tỷ lệ hormone chuyển từ cytokinin sang auxin.
Môi trường ra rễ (nhóm Lata, 2009) [6]
- Muối khoáng MS pha một nửa nồng độ
- 500 mg/L than hoạt tính (bột than mịn, hút các chất gây hoá nâu và một phần hormone)
- 2,5 µM IBA (khoảng 0,5 mg/L, tức 0,5 mL dung dịch gốc 1 mg/mL cho mỗi lít)
- Không có cytokinin
- 7 g/L agar
- pH 5,7–5,8
Công thức này cho tỷ lệ ra rễ 95%. Rễ thường xuất hiện trong 2–3 tuần. Cây con sẵn sàng cho Giai đoạn 4 khi rễ dài 1–2 cm và thấy rõ lông hút.
Cách khác: ra rễ bên ngoài hộp (ex vitro). Một số cách làm bỏ qua môi trường ra rễ. Chồi được lấy thẳng từ môi trường nhân chồi và nhúng thuốc kích rễ (dạng gel hoặc bột IBA). Sau đó cắm vào giá thể vô trùng và đậy chụp giữ ẩm. Cách này tiết kiệm thời gian và chi phí môi trường. Bù lại, bạn phải kiểm soát độ ẩm và nhiệt độ chặt hơn trong giai đoạn chuyển tiếp.
Ghi chú của người dịch: Ra rễ bên ngoài hộp gần giống cách giâm cành mà nhiều người trồng ở Thái đang làm. Vào mùa nóng, chụp giữ ẩm đặt dưới nắng trực tiếp hoặc trong phòng không có điều hoà có thể nóng lên rất nhanh. Hãy để chụp trong phòng có điều hoà và đặt một nhiệt kế bên trong chụp.
Việc cần làm: Chia một lô của cùng một giống làm hai nửa, mỗi nửa ra rễ theo một cách. Sau 3 tuần, so sánh số chồi ra rễ và sống được ở mỗi cách.
Giai đoạn 4: Thuần hoá (cho cây quen dần với môi trường bên ngoài)
Nhiều người trồng mất cây ở giai đoạn này. Trong hộp, cây con sống ở độ ẩm gần 100% và nhiệt độ ổn định. Cây được nuôi bằng đường trong thạch và chưa bao giờ gặp gió. Chuyển đột ngột ra không khí phòng bình thường là thay đổi quá lớn, nên cây phải được cho quen dần từng bước.
Các bước thuần hoá
- Lấy cây con ra, rửa nhẹ phần thạch bám ở rễ bằng nước ấm. Thạch có đường còn sót trên rễ sẽ nuôi nấm mốc.
- Trồng vào giá thể vô trùng đã làm ẩm trước: than bùn (peat) và đá trân châu (perlite) theo tỷ lệ 70:30, hoặc len đá (rockwool).
- Đặt dưới chụp giữ ẩm ở độ ẩm tương đối 90–95%, 22–25 °C và 100–150 PPFD. PPFD đo lượng ánh sáng cây sử dụng được chiếu tới cây, tính bằng µmol/m²/s.
- Ngày 1–7: đậy kín chụp.
- Ngày 7–14: bắt đầu hé chụp, lần lượt 1 giờ, rồi 2 giờ, rồi 4 giờ.
- Ngày 14–21: bỏ hẳn chụp.
- Từ tuần thứ 4: chuyển sang điều kiện và chế độ bón của giai đoạn sinh trưởng thân lá bình thường.
Theo cách làm chung này, nhóm Lata báo cáo cây đã ra rễ được thuần hoá thành công trong đất [6]. Nhóm ghi nhận tỷ lệ sống 90% ở cây mọc lại từ đoạn thân được bao gói, tức mẩu mô được bọc kín trong hạt gel (mục 8, Phần 2) [7]. Đây là kết quả trong phòng lab, với quy trình đã được tinh chỉnh. Khi làm tại nhà, hao hụt thường cao hơn.
Phần lớn hao hụt tại nhà là do bệnh chết rạp cây con (damping off). Đây là bệnh thối gốc thân ở cây non, do nấm và nấm noãn (water mould) trong giá thể gây ra. Hai cách kiểm soát quan trọng nhất là dùng giá thể vô trùng và tưới cẩn thận, tưới ít.
Ghi chú của người dịch: Rất khó giữ 22–25 °C dưới chụp khi phòng không có điều hoà và nhiệt độ lên 30–35 °C. Vì vậy, hãy làm giai đoạn này trong phòng có điều hoà. Vào mùa mưa, không khí vốn đã ẩm nên giá thể lâu khô hơn. Hãy tưới thưa hơn so với mùa khô.
Việc cần làm: Với mỗi lô, đếm số cây con còn sống vào ngày 21 và tuần thứ 8. Ghi lại nguyên nhân của từng cây bị hỏng, để biết cần sửa ở bước nào.
Nếu bạn đã làm thử bất kỳ giai đoạn nào trong bài với cần sa, hãy đăng công thức, tên giống và số liệu của bạn ngay dưới topic này. Bạn cũng có thể đặt câu hỏi tại đây.
Tài liệu tham khảo
- Adkar-Purushothama, C.R., Sano, T., & Perreault, J.-P. (2023). Hop latent viroid: A hidden threat to the cannabis industry. Viruses, 15(3), 681.
- Punja, Z.K., Scott, C., Tso, H.H., Munz, J., & Buirs, L. (2025). Transmission, spread, longevity and management of hop latent viroid, a widespread and destructive pathogen affecting cannabis (Cannabis sativa L.) plants in North America. Plants, 14(5), 830.
- Bektaş, A., Hardwick, K.M., Waterman, K., & Kristof, J. (2019). Occurrence of hop latent viroid in Cannabis sativa with symptoms of cannabis stunting disease in California. Plant Disease, 103(10), 2699.
- Monthony, A.S., Page, S.R., Hesami, M., & Jones, A.M.P. (2021). The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants, 10(1), 185.
- Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3), 473–497.
- Lata, H., Chandra, S., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2009). Thidiazuron-induced high-frequency direct shoot organogenesis of Cannabis sativa L. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 45(1), 12–19.
- Lata, H., Chandra, S., Mehmedic, Z., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2012). In vitro germplasm conservation of high Δ9-tetrahydrocannabinol yielding elite clones of Cannabis sativa L. under slow growth conditions. Acta Physiologiae Plantarum, 34(2), 743–750. Client Challenge
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2011). Molecular analysis of genetic fidelity in Cannabis sativa L. plants grown from synthetic (encapsulated) seeds following in vitro storage. Biotechnology Letters, 33(12), 2503–2508.
Bài viết thuộc loạt bài giáo dục của Asiannabis Community. Nội dung chỉ dùng cho mục đích giáo dục và hợp pháp, tại những nơi cho phép trồng cần sa.
Xem tiếp Phần 2: Nuôi cấy mô và vi nhân giống cần sa: Làm sạch Hop Latent Viroid, phòng lab tại nhà, lưu giữ giống và điều kiện nhiệt đới (Phần 2/2)