本篇讲大麻种植者使用组织培养的主要原因：培育不带啤酒花潜伏类病毒（HLVd）的植株。本篇还讲小型实验室的搭建、大麻特有的问题、没有母株时如何保存栽培品种（cultivar）、认证生产，以及在泰国高温下运行培养室。这里的组织培养，是指把很小的植物组织块放在无菌容器里的营养凝胶上培养，繁殖出大量完全相同的植株。
本文参考了八项已发表的研究，列在“参考文献”中，方括号里的数字就是对应的文献编号。章节从第5节开始，因为上篇已包含第1–4节：什么是组织培养、它与扦插相比如何、控制培养过程的激素，以及四个操作阶段和配方。
本文为下篇。上篇：https://asiannabis.com/t/1228
5. 清除啤酒花潜伏类病毒：使用组织培养的主要原因
什么是类病毒
HLVd是一小段环状的致病RNA。它没有蛋白质外壳，也没有自己的基因，会感染整株植物。它最早在啤酒花（给啤酒调味的植物）中被发现。2019年，美国加利福尼亚州首次报告了大麻中的HLVd，论文发表在期刊 Plant Disease 上[3]。
2023年期刊 Viruses 上的一篇综述指出，加州约90%的大麻种植设施检测呈阳性。该综述估计，行业损失每年最高可达40亿美元[1]。
症状及出现时间
“潜伏”（latent）就是隐藏的意思。许多受感染的植株在开花前看起来一切正常，到开花时损害才显现出来：
- 植株矮化，花簇发育较差，植株变小[2]
- 有柄腺毛（即大的树脂头）减少，小而发育不良的腺毛增多[2]
- 有报告称THC含量损失50–70%，大麻素和萜烯产量最多减少50%[1]
- 茎秆变脆，有时叶片畸形
症状出现得晚，所以一株母株可能多年看起来都很健康，而从她身上剪下的每一根插条都带着类病毒。
怎么做： 如果你保留多年的某个栽培品种现在长得更矮、树脂变少，先送检，再考虑调整施肥或灯光。
传播途径：比大多数种植者以为的更多
2025年，Punja及其同事研究了北美大麻中的HLVd，确认了四条传播途径[2]：
- 插条。 受感染母株的每一根插条都带毒。
- 根与根接触，发生在营养液循环使用的水培系统中。
- 茎上的伤口，来自被污染的刀片、支撑网和打叶操作。
- 种子和花粉，可导致最高100%的幼苗受感染。
同一项研究发现，在室温下，类病毒在压碎的叶片汁液中可检出7天，在干燥的叶片或根中可检出4周[2]。所以，从种子开始种并不能自动保证安全；留在房间里的植物残渣也会让类病毒一直存在。
译者注：许多泰国农场互相分享插条，又使用循环系统，等于同时占了途径1和途径2。研究中的“室温”并不是30–35 °C的泰国种植房。不要以为高温会让残渣里的类病毒更快消失，要把残渣清走。在拿到实验室检测结果之前，把每一根买来的插条都当作未经检测。
怎么做： 每剪完一株就给剪枝工具消毒，而不是换房间时才消毒。每次收获后，把叶、根、茎全部清出房间。哪些消毒剂对工具有效，见上文链接的HLVd主题。
为什么插条解决不了问题
HLVd存在于维管组织中，也就是植物体内输送水分和汁液的通道。所以受感染母株的每一根插条都带毒。没有任何化学处理能治好受感染的植株。可靠的方法有：
- 茎尖分生组织培养。 分生组织是枝条顶端的生长点。你切下的外植体要非常小（0.4 mm，带两个或更少的叶原基，即将来长成叶子的小突起），小到维管组织还没长到那里。Punja等人报告，这样得到的植株平均约41%检测为HLVd阴性。在八个基因型（基因型指一个栽培品种的遗传组成）之间，这一比例从0%到100%不等[2]。
- 分生组织培养结合热处理或冷处理。 把植株放在36 °C下14天，能迅速降低类病毒滴度（组织中类病毒的含量）。冷处理（2–4 °C、黑暗条件下8–21个月）结合小分生组织培养，效果比单用任何一种方法都好[1]。
结果取决于基因型，所以没有一个适用于所有栽培品种的统一成功率。正因如此，每一株分生组织培养出来的小苗都必须做RT-qPCR检测（一种检测类病毒遗传物质的实验室检测），之后才能说它无毒。只有阴性苗才能进入增殖阶段。证明植株无毒的是检测结果，而不是所用的技术。
逐步清除一个品系：分生组织培养结合热处理或冷处理
综合已发表的结果，一次清毒流程如下：
- 确认问题。 用RT-qPCR检测母株，确认她已受感染。
- 可选的热处理或冷处理。 把植株在36 °C下保持14天以降低滴度，或采用上文的冷处理[1]。
- 切取尽可能小的茎尖。 在放大条件下，切取小于0.5 mm、带两个或更少叶原基的分生组织茎尖[1][2]。
- 多启动一些茎尖。 每个希望保留的无毒品系，启动10–20个茎尖（见上篇第1阶段）。
- 检测每一株小苗，等它长出足够取样的组织时再测。保留阴性苗，丢弃阳性苗。
- 只增殖阴性苗。 在记录中给每个无毒品系一个独立编号。工具、根系或花粉都可能把类病毒重新带进来，所以要定期复检无毒母株品系。
译者注：36 °C接近泰国热季的气温，但热房间不等于热处理。该综述报告了在36 °C下保持14天的做法，但没有说明光照和湿度条件，还指出植株在田间种了六个月后滴度又回升了[1]。温室温度每天忽高忽低，做不到受控的恒温保持。综述中的冷处理是在2–4 °C、黑暗中持续8–21个月[1]；本文引用的研究都没有测试过用家用冰箱做这件事。没有经过确认的HLVd检测，分生组织培养得到的品系应标为“未检测”，而不是“无毒”。
怎么做： 挑一个高价值的栽培品种做第一次清毒。切第一个茎尖之前，先找好检测实验室。
6. 在家搭建小型组织培养实验室
你不需要大学那样的实验室。设备清单很短：
| 物品 | 用途 |
|---|---|
| 超净工作台或静气箱 | 提供一个干净的空间，打开容器时不被污染 |
| 额定压力15 PSI的高压锅 | 用加压蒸汽给培养基灭菌 |
| 玻璃或聚碳酸酯容器 | 盛放培养物 |
| 精度0.01 g的秤 | 称量盐类、糖和琼脂 |
| pH计 | 把培养基调到pH 5.7–5.8 |
| 手术刀和镊子 | 切割和转移组织 |
| MS预混粉、琼脂和蔗糖 | 培养基本身 |
| 激素：TDZ或BAP，以及IBA（BAP配方还需要NAA） | 引导组织长芽或长根 |
| 70%乙醇和漂白剂 | 清洁台面和外植体 |
| 低强度LED灯 | 给培养架照明 |
PSI即磅每平方英寸，15 PSI大约比正常气压高1巴。各国价格和进口关税差别太大，这里无法报价。做预算前，请按本地价格把清单核算一遍。
译者注：在泰国，MS预混粉、琼脂和植物激素作为实验室化学品出售。可以询问泰国实验室用品或植物组织培养用品的正规经销商，也可以在论坛“组织培养”版块问问会员们在哪里买。向卖家索取每种产品的数据表，上面会写明如何溶解和储存。
无菌操作：静气箱或超净工作台
每次打开容器，空气中的孢子和细菌都可能落到培养基上。培养基里的糖会养活它们，它们长得比植物组织还快。无菌技术的作用就是把它们挡在外面。
超净工作台是一种柜子，它向台面持续吹出一股经过过滤的气流，把孢子从打开的容器旁吹走。
静气箱是省钱的选择：把一个大的透明塑料收纳箱侧放，开两个伸手用的孔。每次使用前，在箱内喷70%乙醇。它的污染比超净工作台多，所以每个想保留的培养物都要多启动一些外植体。
译者注：以下通用习惯在两种设备中都能减少污染：
- 箱子、工具和每个容器的外壁，放进去之前都用70%乙醇擦拭。
- 洗净双手和前臂，戴上手套，并在手套上喷乙醇。
- 在静气箱里动作要慢，快速动作会搅动空气。
- 只在箱内或工作台内打开容器，手绝不要从打开的容器上方经过。
- 每切完一个外植体，就给手术刀消毒一次。
- 乙醇要远离明火和电热板，它很容易着火。
怎么做： 在切任何大麻组织之前，先做10个装普通培养基的容器，在箱内像真正操作那样打开再盖上。一周后，数一数有多少个变浑浊了，这就是你的初始污染率。
配制培养基
- 按厂家说明称取MS预混粉：全强度通常为4.4 g/L，半强度为2.2 g/L。加入30 g/L蔗糖，用蒸馏水溶解。
- 用激素母液（1 mg/mL，冷冻保存）加入激素。
- 把pH调到5.7–5.8：用1 M氢氧化钠（NaOH）调高，用1 M盐酸（HCl）调低。“1 M”是这两种试剂常见的出售浓度。
- 加入7 g/L琼脂，加热并搅拌至溶解。每个容器倒入25–30 mL。
- 在121 °C / 15 PSI下灭菌15–20分钟，可用高压灭菌器或15 PSI的高压锅。
- 在超净工作台或静气箱内放凉、凝固。
激素母液。 1 mg/mL的母液每毫升含1 mg激素，例如把100 mg激素溶解后定容到100 mL。按各激素数据表上的说明溶解。每升培养基加入1 mL这种母液，浓度就是1 mg/L。
| 培养基 | 激素 | 每升所需母液（1 mg/mL母液） |
|---|---|---|
| 启动 | 0.5 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA | 0.5 mL BAP + 0.1 mL NAA |
| 增殖（BAP） | 1.0–2.0 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA | 1–2 mL BAP + 0.1 mL NAA |
| 增殖（TDZ） | 0.5 µM TDZ（约0.11 mg/L） | 0.11 mL，或1.1 mL 0.1 mg/mL的母液 |
| 生根（半强度MS，500 mg/L活性炭，不加细胞分裂素） | 2.5 µM IBA（约0.5 mg/L） | 0.5 mL IBA |
保质期。 倒好的培养基在室温下可放几周，密封冷藏能放更久。使用前已变浑浊的容器一律丢弃。
译者注：很多厨房用高压锅达不到15 PSI，要查看厂家标注的额定压力。压力低于15 PSI时，蒸汽温度达不到121 °C，培养基可能灭菌不彻底。泰国的房间比温带地区的实验室更热，所以存放的培养基要更勤检查。
怎么做： 在每个培养基容器上写明日期、配方和批次号。这样培养失败时，就能追溯到是哪一批次的问题。
7. 大麻特有的问题
褐变
大麻组织切开后会释放酚类化合物，这是一类天然的植物化学物质，遇到空气会发生反应而变褐。褐变会减缓生长，甚至让外植体死亡。减少褐变的四种方法：
- 在启动培养基中加入活性炭（1–2 g/L）。活性炭也会吸附一部分激素，所以可能需要调整激素用量。
- 在最初24–48小时内把外植体转到新鲜培养基上。
- 使用抗氧化剂，如抗坏血酸（维生素C）或柠檬酸。本文依据的研究没有给出用量，所以请从已发表的组织培养配方入手，先在少量外植体上试。
- 下刀要快，让伤口暴露的时间尽量短。
怎么做： 如果很多外植体褐变，下一批做两处改变：加活性炭，并在24–48小时内转接。然后和上一批的结果对比。
玻璃化的芽（过度水化）
茎尖变得透明、肿胀、像玻璃一样，这也叫玻璃化（vitrification）。这是大麻培养衰退的一种有文献记载的形式。Monthony等人2021年的综述指出，这一现象特别出现在含0.5 µM TDZ的MS培养基上[4]，而这正是增殖效果好的剂量。所以每次用TDZ都要密切观察。
原因：细胞分裂素（促进长芽的激素）过多，密封容器内湿气积聚，盐浓度过高。
解决方法：
- 降低细胞分裂素用量。
- 改用透气盖或带小通气孔的容器。
- 把琼脂提高到8–9 g/L，让培养基表面更干。
- 用BAP代替TDZ培养一个周期。
译者注：在潮湿的热带房间里，要选覆有过滤膜的通气孔，不要用敞开的缝隙，以免孢子进入。
怎么做： 每次只改一个因素，这样你才知道是哪项改动解决了问题。
遗传稳定性：为什么要避免愈伤组织
新芽可以直接从已有的芽上长出来（“芽生芽”，即直接器官发生）。这种方式通常突变很少，长出的植株与母株一致[4]。经过愈伤组织（一团未分化的细胞）再生就不一样了，而且在大麻上也不可靠。在综述涉及的研究中，愈伤组织的再生率低至1.35%，最好的处理也只有14%[4]。
所以，愈伤组织既有遗传风险，又极难成功。两个原因得出的是同样的规则：
- 采用直接器官发生，不要经由愈伤组织再生。
- 细胞分裂素用到仍然有效的最低剂量即可。
- 定期核对品种身份，可以比较肉眼可见的性状（表型），或使用DNA标记。
Lata等人用DNA分析证实了这种核对：从储存的包埋材料再生的植株与原株一致[8]。所以这种核对是有文献依据的做法，并非过度谨慎。
译者注：我们没有找到公开提供大麻栽培品种身份DNA标记检测的泰国实验室。在找到之前，可以比较性状：在相同条件下，把一株来自培养品系的植株和一株来自原母株的植株并排种植。记录株高、开花时间和气味，并拍照。两株都做一份检测报告（COA），还能再加上化学成分的对比。
怎么做： 每隔几个周期，从每个培养品系中挑一株，与一株参照植株并排种出来对比。
8. 包埋种子与慢生长储存
组织培养最有用的用途之一，是在没有活母株的情况下保存栽培品种。
包埋（“人工”）种子
把一段茎或一个茎尖封进一颗海藻酸钠珠子里，海藻酸钠是一种含营养的海藻凝胶。美国密西西比大学的Lata团队在2012年测试了这种方法[7]。他们把包埋的大麻茎段在15 °C下储存最长24周，最高再生和存活率为60%。
再生植株在驯化（炼苗）阶段的存活率为90%，大麻素谱与供体植株一致[7]。另一项2011年的研究用DNA分析证实，从储存后的包埋种子长出的植株，遗传上与原株一致[8]。
请如实看待这些数字：是24周，不是几年；存活率是60%。没有母株房时，包埋是把一个栽培品种保存一季的实用方法。它不能替代种质库，也就是长期保存植物遗传资源的设施。
慢生长储存
培养物也可以不包埋，放在较凉的环境中让它们长得慢一些，从而减少继代培养的次数。在同一项研究中，部分未包埋的培养物加入了渗透剂（甘露醇或山梨醇）。这类物质加入培养基后会限制吸水，从而减缓生长[7]。其中，在测试的最低剂量2%下，再生和存活效果最好[7]。
怎么做： 即使在实验室里，储存的珠子也有约40%死亡。所以每个栽培品种储存的珠子或容器要比所需多出好几倍，不可替代的栽培品种还要保留一份活体备份。保持15 °C所需的设备见第10节。
9. 认证医用级生产中的组织培养
有些农场瞄准医药市场，例如欧盟GMP标准（EU-GMP）的买家，或通过泰国FDA（泰国食品药品管理局）出口。对这些农场来说，组织培养能提供用插条很难得到的记录，用于支持GACP（良好农业与采集规范）和GMP审核：
- 明确的起始材料： 每个批次都能追溯到一个已知的、做过病原检测的母本培养物。
- 批次均一，质量控制更简单。
- 有记录的病原清除： 分生组织培养之后，再用RT-qPCR检测确认。
- 审核追溯记录： 每一次继代培养都记下日期、培养基成分和操作人员。
译者注：在泰国，根据泰国卫生部《管控草药（大麻）公告》佛历2568年，大麻花属于管控草药，该公告自2025年6月26日起生效。自2026年4月30日起，《管控草药部级条例（第2号）》佛历2569年收紧了大麻花的许可标准。《大麻管制法》草案尚未成为法律：内阁于2026年9月22日批准该草案，并已提交众议院。本文不讨论生产或转让大麻组培苗是否需要单独的许可证。向其他农场出售或赠送组培苗之前，请以书面形式询问给你签发许可证的主管部门。
怎么做： 现在就建立记录表，小实验室也一样。列出以下各栏：日期、栽培品种、母株编号、培养基批次、激素用量、操作人员、转入和转出的芽数、污染情况、检测结果。
10. 在热带气候下运行培养室
大多数已发表的方法来自气候较凉的实验室。在泰国和整个东南亚，有三项调整很重要。
- 先控制室温。 培养物要保持在24–26 °C，而室外气温通常更高。所以培养室需要一台独立的空调持续运行，还要有停电应对方案。一个在25 °C下能撑过24小时的培养物，在34 °C下可能撑不过24小时。停电时空调停转，室温向室外温度攀升，培养物就会过热。
- 空气中的霉菌孢子会更多。 在干燥、凉爽的房间里效果尚可的静气箱，到了潮湿的房间里污染会更多。在你最干净、最少使用的房间里操作，两次操作之间保持箱子关闭，并且比国外配方建议的多启动一些外植体。
- 15 °C储存需要专门设备。 家用冰箱的温度在4 °C左右；要稳定保持15 °C，需要酒柜或温控柜。在按24周储存来做计划之前，先把这笔钱算进预算。
译者注：如果你所在的地方经常停电，可以考虑配一台能带动空调的发电机或电池备用电源。用一支能记录最高温度的温度计，就能知道停电期间房间最高热到多少度。雨季湿度最高，所以这几个月要多启动一些外植体。
怎么做： 开始培养之前，连续两周每天记录两次培养室温度，看看你的制冷能否把温度保持在24–26 °C。
11. 什么时候不值得做组织培养
- 小规模家庭种植（每个周期1–10株）： 扦插更快、更便宜，也不需要设备。组织培养的优势随规模增大而增加。
- 自动开花品种： 它们不能作为母株保留。可以拿来培养，但用于日常繁殖并不现实。
- 用种子种一次就结束： 如果你不打算保留这份遗传，组织培养只会增加工作量，没有好处。
- 预算紧张： 只有当你每个周期需要大量克隆苗，或者确实需要无病原材料时，设备成本和学习时间才划算。
译者注：对泰国大多数家庭种植者来说，一个更便宜的方案就能覆盖大部分同样的风险。从你核实过的卖家那里买种子。种子也可能携带HLVd，有条件就送检。保留一株检测过的母株，每剪完一株就给工具消毒，买来的插条要先隔离。
怎么做： 统计你每个周期取多少克隆苗，以及因疑似类病毒或其他病害损失了多少株。如果两个数字都很小，就继续用扦插。
12. 入门：实用计划
第1–2个月。 先用便宜、容易成功的植物练习无菌技术，如绿萝或非洲紫罗兰。自己做或买一个静气箱。配制MS培养基，并练习灭菌。目的是在拿大麻组织冒险之前，先学会控制污染。
第2–3个月。 从一株健康、检测过的母株上取茎段，开始你的第一批大麻培养。启动的数量要远多于所需，并做好大量损耗的准备。学会分辨正常生长和污染。
第3–6个月。 对存活下来的培养物做继代培养。针对你的栽培品种调整细胞分裂素用量，这一步任何已发表的配方都替你做不了。开始做生根和驯化试验。
第6个月起。 用茎尖分生组织培养清除类病毒，并用RT-qPCR确认每个品系。连续几个周期，按栽培品种记录增殖率和衰退率。然后根据你自己的数据编写标准操作规程（逐步写明的操作方法）。
译者注：绿萝是泰国和东南亚常见的室内植物，练习材料很容易找到。
组织培养比扦插要花更长时间才能学会。作为回报，规模化种植者能得到无类病毒的品系，能大规模繁殖，还能在没有母株房的情况下把品种保存几个月。
怎么做： 现在就把第1–2个月的任务写进日历，只购买这一阶段需要的设备。
如果你试过用组织培养繁殖大麻，欢迎在本主题下方留言：说说你遇到的最大问题（污染、驯化还是其他），以及你的栽培品种、培养基配方和数量统计。也欢迎提问。
参考文献
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- Punja, Z.K., Scott, C., Tso, H.H., Munz, J., & Buirs, L. (2025). Transmission, spread, longevity and management of hop latent viroid, a widespread and destructive pathogen affecting cannabis (Cannabis sativa L.) plants in North America. Plants, 14(5), 830.
- Bektaş, A., Hardwick, K.M., Waterman, K., & Kristof, J. (2019). Occurrence of hop latent viroid in Cannabis sativa with symptoms of cannabis stunting disease in California. Plant Disease, 103(10), 2699.
- Monthony, A.S., Page, S.R., Hesami, M., & Jones, A.M.P. (2021). The past, present and future of Cannabis sativa tissue culture. Plants, 10(1), 185.
- Murashige, T., & Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 15(3), 473–497.
- Lata, H., Chandra, S., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2009). Thidiazuron-induced high-frequency direct shoot organogenesis of Cannabis sativa L. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 45(1), 12–19.
- Lata, H., Chandra, S., Mehmedic, Z., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2012). In vitro germplasm conservation of high Δ9-tetrahydrocannabinol yielding elite clones of Cannabis sativa L. under slow growth conditions. Acta Physiologiae Plantarum, 34(2), 743–750. https://doi.org/10.1007/s11738-011-0874-x
- Lata, H., Chandra, S., Techen, N., Khan, I.A., & ElSohly, M.A. (2011). Molecular analysis of genetic fidelity in Cannabis sativa L. plants grown from synthetic (encapsulated) seeds following in vitro storage. Biotechnology Letters, 33(12), 2503–2508.
本文是Asiannabis社区教育系列的一部分，仅供在允许种植大麻的地区用于合法的教育目的。